聊聊：PBMC分离相关问题
想要在速分离的同时保证PBMC的得率和纯度，需要注意一下几个方面：一．抗凝剂的选择：
若后续需要进行ELISPOT验以及细胞培养验，采血时需要选择肝素抗凝剂，因为EDTA抗凝剂通过螯合钙抑制凝血，螯合钙可能在抗原特异性再刺激过程中损害细胞因子分泌。
二．比较佳分离温度
包括分离管在内的分离产物的比较佳分离温度为（20±5）℃。当温度过高时，主要由蔗糖组成的分离液密度会降低，一些淋巴细胞会进入分离层；如果温度过低，主要由蔗糖组成的分离溶液的密度会增加，红细胞在低温下也会减少聚集。因此，与室温条件相比，红细胞难以沉淀在分离溶液层下方，并且容易混合到PBMC层中。因此，在分离过程中，有必要确保血样和分离管都处于室温。
．冷藏血分离注意事项
如果使用冷冻血液进行分离，PBMC层中的红细胞通常会更多，PBMC的活性会受到一定影响。建议在分离前将血样恢复到室温，并适当延长离心时间，例如30分钟。需要注意的是，如果血液样本冷藏很长时间，即使血液样本已经恢复到室温，离心时间已经延长，分离效果也法与新鲜血液样本相比。建议将血液储存在室温下，储存时间不超过2小时。
四．血样用量
利用红细胞将原本位于管底的分离液置换到红细胞上方，分离液则将密度相对较小的PBMC和血浆高到筛板上方，而血液中的红细胞数量是固定的，如果血液的用量太少，则分离后红细胞的置换效果差，PBMC可能会紧贴分离管中的筛板，难以吸出，此时即使稀释血样也法改善分离效果。也因此红细胞沉降液并不推荐搭配分离管使用，沉降处理后红细胞量变少，置换效果差。
如果血液的用量太多，则可能导致红细胞超过筛板，PBMC层模糊、分离效果下降。综上，15mL分离管的血样推荐用量为3mL~6mL；50mL分离管的血样推荐用量为15mL~25mL。
五．取出PBMC的方法
使用分离管分离出PBMC后，可以选择直接倒出或吸出PBMC，若需要相对更高的细胞得率，可选择直接倒出筛板上方的液体；若需要相对更高的细胞纯度，可选择巴氏吸管或移液吸出PBMC。
六．使用什么方式进行PBMC计数
AOPI：可以将有核的活细胞和有核的死细胞分开计数，且红细胞不染色，其中AO可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞（活细胞和死细胞）的细胞核，呈现绿色荧光；PI只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光。此时活死PBMC可呈现荧光信号。而成熟的红细胞及血小板，因为没有细胞核，不能被AOPI染色，因此可以完全被排除在外不被计数。
乙酸亚甲基蓝：3%乙酸亚甲基蓝可以计数有核细胞，但不能区分死活细胞。其中3%乙酸可以破坏细胞膜；亚甲基蓝可以结合核酸，使细胞核染色。细胞计数过程中所有细胞的细胞膜都会被裂解，但红细胞没有细胞核所以不会被计算在内。虽然3%乙酸亚甲基蓝计数法不能区分死活细胞，但一般来说红细胞会比死细胞多，所以这个计数法也可以使用。
台盼蓝：正常活细胞细胞膜结构完整，台盼蓝不能进入细胞内，活细胞呈透明状；通常细胞膜完整性丧失时，即可认为细胞已经死亡，因此对于死细胞或细胞膜不完整的细胞来说，细胞膜通透性增加，台盼蓝可以进入细胞内，把细胞染成蓝色，所以台盼蓝可以区分活死细胞，但不能区分红细胞和有核细胞。
泰克生物具有成熟的动物PBMC分离技术，保证细胞分离过程中不受损害、不被刺激，后期的纯化技术保证骆驼单个核细胞的纯度以及活率等技术指标，适用于后期的细胞培养、抗体制备等其他研究。
PBMC分离从外周血、骨髓、外周淋巴器官或各种组织分离出来的细胞是多种细胞的混合物。如要研究某种特定细胞的结构、功能或表面标志等特征，首先要分离纯化细胞。细胞分离可根据其大小、密度、表面电荷、吸附能力或表面抗原的差异而采用密度梯度沉降法、贴附、亲和层析、化环形成、补体介导杀伤溶解、免疫磁珠以及流式细胞仪（FCM）等方法来进行纯化。
一．Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMC原理
常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是1077±0001kgL的聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografn）（FH）分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，亲水性高，平均分子量为400000。当密度为12gml仍未超出止常生理性渗透压，也不透过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
图1PBMC分离示意图
二．PBMC分离的验步骤
1在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2取肝素抗凝静脉血与等量Hanks液或RPMI1640液充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm，20min。
3离心后管内分为层，上层为血浆和Hank's液、下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一处以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4用弯头滴管插到云雾层，仔细吸取单个核细胞；也可采用先吸弃上层RPMI1640和血浆，然后收集富含PBMC的云雾层。将云雾层细胞置人另一短中管中，加人5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm离心10min，洗涤细胞两次。
5末次离心后，弃上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴02%台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。单个核细胞浓度（细胞数1ml细胞悬液）=4个大方格内细胞总数4×104×2（稀释倍数）。
6细胞活力检测：死的细胞可被染成蓝色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。活细胞百分率（%）=活细胞数总细胞数×100%。
7细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105ml培养基，加于六孔板或24孔板中进行培养。
8细胞收集：将六孔板或二十四孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200μLTrizol，用移液将孔壁吹打数次后，将Trizol转入EP管中。
9细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。
．验过程中的注意事项
1Ficoll应适量，外周血应充分稀释。
2温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果。
3在Ficoll上加入稀释后的外周血时，应缓慢加，以免冲散界面。
4吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染。
四．泰克生物羊驼PBMC产品势
1细胞活率高：验中使用的分离试剂菌、低内素，对细胞伤害刺激，操作人员具备多年PBMC细胞分离经验，比较大程度保证细胞的原始状态，分离后的新鲜细胞或冻存复苏后的活率可达90%以上。
2产品安全性高、传染源：严格把控羊驼骆驼全血来源，保证验骆驼均经过相关传染源检测，为客户提供更安全、更放心的验材料。
3细胞来源清晰、可溯源：分离羊驼骆驼使用的全血均由正规动物中心提供采集，具备完全合规的采购流程以及全血生物安全证书，免除客户使用的后顾之忧。
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作为行业的代表，抗体开发需要给同行们做出一定的表率，在产品质量上要一路领先才可以。泰克生物为客户提供基于M13噬菌体抗体展示系统的高亲和力、高特异性的抗体药物前期发现技术服务，为客户后续的CAR-T/CAR-NK先导序列设计、抗体人源化、药物靶点抗体开发、双特异性抗体开发以及高效阻断型中和抗体开发等下游研发工作提供有力支持。https://www.tekbiotech.com/http://iyanhui.cn/data/attachment/forum/202411/21/103313nuoo1zouuzo8tk4t.png
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